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Jun 27, 2023

SARS

Virology Journal Band 19, Artikelnummer: 193 (2022) Diesen Artikel zitieren 1540 Zugriffe auf 2 Altmetric Metrics-Details Eine globale Pandemie ist im Gange, die durch das schwere akute respiratorische Syndrom verursacht wird

Virology Journal Band 19, Artikelnummer: 193 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Eine globale Pandemie ist im Gange, die durch das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) verursacht wird. Das SARS-CoV-2-Genom enthält wie sein Vorgänger SARS-CoV offene Leserahmen, die akzessorische Proteine ​​kodieren, die an Virus-Wirt-Interaktionen beteiligt sind, die während der Infektion aktiv sind und wahrscheinlich zur Pathogenese beitragen. Eines dieser akzessorischen Proteine ​​ist 7b mit nur 44 (SARS-CoV) und 43 (SARS-CoV-2) Resten. Eine vorhergesagte Transmembrandomäne ist vollständig konserviert, was auf eine funktionelle Rolle schließen lässt, wohingegen die größte Variabilität im vorhergesagten zytoplasmatischen C-Terminus enthalten ist. Bei SARS-CoV wird das 7b-Protein in infizierten Zellen exprimiert, und die Transmembrandomäne war für die Golgi-Lokalisierung notwendig und ausreichend. Auch in den Seren rekonvaleszenter SARS-CoV-Patienten wurden Anti-p7b-Antikörper gefunden. In der vorliegenden Studie haben wir die Hypothese untersucht, dass das SARS-2 7b-Protein Oligomere mit Ionenkanalaktivität bildet. Wir zeigen, dass 7b in beiden SARS-Viren fast vollständig α-helikal ist und eine einzige Transmembrandomäne besitzt. In SDS bildet 7b verschiedene Oligomere, von Monomeren bis zu Tetrameren, aber nur Monomere, wenn es Reduktionsmitteln ausgesetzt wird. Die Kombination von SDS-Gelelektrophorese und analytischer Ultrazentrifugation (AUC) sowohl im Gleichgewichts- als auch im Geschwindigkeitsmodus lässt auf ein Dimer-Tetramer-Gleichgewicht schließen, in Gegenwart eines Reduktionsmittels jedoch auf ein Monomer-Dimer-Tetramer-Gleichgewicht. Diese Daten deuten darauf hin, dass zwar Disulfid-verknüpfte Dimere vorhanden sein können, diese jedoch für die Bildung von Tetrameren nicht unbedingt erforderlich sind. Die Einbeziehung von Pentameren oder höheren Oligomeren in das SARS-2-7b-Modell wirkte sich nachteilig auf die Anpassungsqualität aus. Vorläufige Modelle dieser Assoziation wurden mit AlphaFold2 erstellt und zwei alternative Modelle wurden einer Molekulardynamiksimulation in Gegenwart einer Modelllipidmembran unterzogen. Allerdings lieferte keines der beiden Modelle einen offensichtlichen Pfad für Ionen. Um dies zu bestätigen, wurde SARS-2 p7b mithilfe der planaren Doppelschichtelektrophysiologie untersucht. Die Zugabe von p7b zu Modellmembranen führte zu einer gelegentlichen Membranpermeabilisierung, was jedoch nicht mit echten Ionenkanälen übereinstimmte, die aus einer tetrameren Anordnung von α-Helices bestanden.

Coronaviren (CoV) sind Krankheitserreger bei Wirbeltieren, die beim Menschen Atemwegserkrankungen verursachen, die typischerweise die Atemwege und den Darm betreffen. Es ist bekannt, dass sie beim Menschen Erkältungssymptome und bei Vögeln und Säugetieren eine Reihe tödlicher Krankheiten verursachen [1]. Im Jahr 2003 verursachte das für das schwere akute respiratorische Syndrom (SARS-CoV) [2] verantwortliche Virus, im Folgenden als SARS bezeichnet, jedoch eine Beinahe-Pandemie mit 8.098 Infizierten und 774 Todesfällen, was einer Sterblichkeitsrate von 10 % entspricht [3]. Derzeit herrscht eine weltweite Pandemie der Coronavirus-Krankheit 19, also COVID-19, (https://www.who.int/health-topics/coronavirus), die durch SARS-CoV-2, im Folgenden SARS-2 [4], verursacht wird Zum Zeitpunkt der Erstellung dieses Manuskripts war die Krankheit im Gange, die 410 Millionen Menschen infizierte und mehr als sechs Millionen Todesfälle verursachte [5]. Es ist wichtig, dringend alle möglichen pharmazeutisch zugänglichen therapeutischen Ziele in SARS-2-Proteinen und Wirtsinteraktionen zu erforschen [6]. CoVs gehören zur Familie Coronaviridae, Unterfamilie Coronavirinae, und sind in vier Gattungen unterteilt [7]. In den Genomen von CoVs kodieren die ersten zwei Drittel nichtstrukturelle Gene; Die offenen Leserahmen ORF1a und ORF1b produzieren die Polyproteine ​​pp1a und pp1ab, die zu 16 nichtstrukturellen Proteinen (nsp1 bis 16) verarbeitet werden. Das letzte Drittel des Genoms beherbergt die ORFs für Strukturproteine: Spike (S), Hülle (E), Membran (M) und Nukleoprotein (N) sowie andere sogenannte „akzessorische“ Proteine, die in Anzahl und Reihenfolge variieren sogar unter CoVs, die derselben Abstammungslinie angehören [8,9,10].

Spezifisch für SARS-CoVs sind acht ORFs, die akzessorische Proteine ​​kodieren, nämlich die ORFs 3a, 3b, 6, 7a, 7b, 8a, 8b und 9b [11, 12]. Obwohl diese Proteine ​​als nicht wesentlich für die Virusreplikation in vitro angesehen wurden [13,14,15], wurde festgestellt, dass mehrere von ihnen an Virus-Wirt-Interaktionen während der Infektion in vivo beteiligt sind [13, 16]. Zusätzliche Proteine ​​können dem Virus im natürlichen Wirt biologische Vorteile verleihen und zur Pathogenese beitragen [11]. Bei SARS wurde vorhergesagt, dass Protein 7b (im Folgenden p7b) durch Leaky-Scanning von einem zweiten ORF, der in SARS-CoV sgRNA7 vorhanden ist, translatiert wird [17], und die Expression wurde in infizierten Vero-Zellen bestätigt [18]. Obwohl keine Experimente durchgeführt wurden, um die Expression von p7b in Gewebeproben von SARS-Patienten nachzuweisen, weist das Vorhandensein von Anti-p7b-Antikörpern in Seren rekonvaleszenter SARS-Patienten darauf hin, dass p7b wahrscheinlich in vivo exprimiert wird [19], und dies wurde auch berichtet in gereinigten Virionen vorhanden [18]. Bei SARS ist p7b 44 Aminosäuren lang und verfügt über ein stark hydrophobes Polypeptid, von dem vorhergesagt wird, dass es die Membran durchdringt, mit einem luminalen N-Terminus und einem zytoplasmatischen C-Terminus [18]. Die Lokalisierung von p7b ähnelt der von p7a und findet sich im gesamten Golgi-Kompartiment sowohl in SARS-infizierten Zellen als auch in mit 7b-cDNA transfizierten Zellen [18]. Es wird in das SARS-Virion eingebaut, aber auf der Zelloberfläche der transfizierten Zellen nicht nachgewiesen [18]. Es wurde festgestellt, dass die Transmembrandomäne von p7b, insbesondere die Reste 21–23 und 27–30, für die Golgi-Lokalisierung sowohl notwendig als auch ausreichend ist [20]. Es wurde festgestellt, dass SARS ORF7b für die Replikation in vitro oder in vivo nicht essentiell ist [15, 18, 21]. Allerdings wies ein Prototypvirus (Stamm Frankfurt-I), der während des SARS-Ausbruchs 2003 isoliert wurde [22], eine 45-nt-Deletion in der Transmembrandomäne von ORF7b und einen Replikationsvorteil in einigen Zellen auf [23], was auf eine abschwächende Rolle von p7b hindeutet. Außerdem zeigten Studien mit siRNA, die für SARS-CoV sgRNA7 spezifisch ist, eine Unterdrückung der Expression von 7a, 7b, 8a und 8b [24], was darauf hindeutet, dass p7a/p7b (und p8a/p8b) bestimmte Rollen während des SARS-Replikationszyklus spielen könnten. Es wurde gezeigt, dass p7b in infizierten Zellen Apoptose auslösen kann [25], die Bedeutung davon im viralen Lebenszyklus ist jedoch nicht klar [26].

Die aktuelle globale COVID-19-Pandemie wird durch SARS-2 verursacht, das wie sein SARS-Vorgänger auch akzessorische Proteine ​​kodiert. Die Sequenz von p7b in SARS-2 ist einen Rest kürzer (43 Reste) als die in SARS, und ihre vorhergesagte Transmembrandomäne ist vollständig konserviert (Abb. 1), was auf eine funktionelle Rolle schließen lässt. Insgesamt beträgt die Sequenzidentität 88 %, wobei > 90 % der Variabilität im vorhergesagten zytoplasmatischen C-Terminus enthalten sind. Kürzlich wurde gezeigt, dass SARS-2 p7b die durch Tumornekrosefaktor-α (TNF-α) vermittelte Apoptose in Zellen vermittelt [27]. Mit Ausnahme einer Studie, die zeigt, dass SARS-2 7b in SDS-Gelen Oligomere bildet, und einem Vorschlag für ein hypothetisches pentameres Modell ähnlich Phospholamban ist in der Literatur jedoch keine weitere experimentelle Charakterisierung von p7b verfügbar [28].

Sequenzen von SARS2 und SARS p7b, wobei die vorhergesagte Transmembrandomäne (TMD) unterstrichen ist

In der vorliegenden Studie haben wir die Hypothese untersucht, dass SARS-2 p7b Oligomere mit Ionenkanalaktivität bildet. Die Oligomergröße wurde erstmals mithilfe der analytischen Ultrazentrifugation (AUC) in den Modi Sedimentationsgleichgewicht (SE) und Sedimentationsgeschwindigkeit (SV) bestimmt, während mögliche Kanalaktivität mithilfe planarer Lipiddoppelschichten getestet wurde. Abschließend schlagen wir ein vorläufiges Modell für die Wechselwirkung der 7b-Monomere vor, das durch eine Molekulardynamiksimulation in Gegenwart einer Lipidmembran erhalten wurde.

Das 43 Reste lange SARS-2 p7b wurde als Rohpeptid erhalten und mit amidiertem C-Terminus und freiem N-Terminus synthetisiert (Genscript, USA). SARS p7b wurde intern mit amidiertem C-Terminus und freiem N-Terminus unter Verwendung mikrowellenunterstützter Festphasen-Fluorenylmethyloxycarbonyl (FMOC)-Chemie unter Verwendung eines Odyssey Microwave-Peptidsynthesizers (CEM Corporation, USA) synthetisiert. Das Protein wurde mit Trifluoressigsäure (TFA) vom Harz abgespalten und lyophilisiert. Die Peptide wurden in TFA (10 μl) gelöst und anschließend mit Acetonitril auf eine Endkonzentration von 5 mg/ml verdünnt. Die Lösung wurde in eine C4-300 Å Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographiesäule (RP-HPLC) (Phenomenex, Cheshire, UK) injiziert, die an ein HPLC-System (Shimadzu, Japan) angeschlossen war. Die verwendeten Lösungsmittel waren Lösungsmittel A: Wasser mit 0,1 % TFA (v/v) und Lösungsmittel B: Isopropanol/Acetonitril (4:1 v/v) mit 0,1 % TFA (v/v). Das Peptid wurde mit einem linearen Gradienten von 30 bis 75 % des Lösungsmittels B eluiert. Die gepoolten Fraktionen wurden lyophilisiert und die Reinheit der Proben wurde durch MALDI-TOF-MS überprüft. Die Transmembrandomäne (p7b-TM) wurde auf die gleiche Weise synthetisiert und gereinigt.

Die Rekonstitution von p7b in Lipidmembranen erfolgte zunächst durch Mischen des lyophilisierten Proteins in TFE mit LPRm (molares Lipid-zu-Protein-Verhältnis) von 20 für DMPC-Lipid oder „ERGIC-Lipid-Mischung“ (POPC: POPE: Rinder-PI: POPS: Cholesterin, im Molverhältnis 45:20:13:7:15) in Chloroform. Lipide wurden von Avanti Polar Lipids (Alabaster, USA) gekauft. Die Mischung wurde unter einem N2-Strom getrocknet und über Nacht im Vakuum inkubiert, bevor sie durch Vortexen und Gefrier-Auftauen in Wasser resuspendiert wurde. Die Rekonstitution von 7b-TM wurde durch Mischen von in Ethanol gelöstem Lipid und Peptid erreicht. Anschließend wurde das Lösungsmittel mit N2-Gas verdampft und die Probe in Wasser rehydratisiert.

FTIR-Spektren wurden mit einem Nicolet Nexus 560-Spektrometer (Madison, USA) aufgezeichnet, das mit N2 gespült und mit einem mit flüssigem Stickstoff gekühlten MCT/A-Detektor ausgestattet war. Die Spektren der abgeschwächten Totalreflexion (ATR) wurden mit einem 25-Reflexions-ATR-Zubehör von Graseby Specac (Kent, UK) und einem Drahtgitterpolarisator (0,25 mM, Graseby Specac) gemessen. Ungefähr 100 μl Probe in Wasser mit einem LPR-Molverhältnis von 20:1 wurden auf ein trapezförmiges (50 × 2 × 20 mm) Ge-Innenreflexionselement (IRE) aufgetragen. Ein trockener oder D2O-gesättigter N2-Strom, der durch die ATR-Abteilung strömte, wurde verwendet, um große Wassermengen zu entfernen bzw. einen D2O-Austausch zu erreichen. Insgesamt wurden 200 Interferogramme, die mit einer Auflösung von 4 cm−1 gesammelt wurden, für jede Probe gemittelt und mit Einpunkt-Nullfüllung und Happ-Genzel-Apodisierung verarbeitet. Der Prozentsatz der in der Membran eingebetteten Aminosäuren wurde aus einem Amidwasserstoff-Deuterium-Austauschexperiment ermittelt, bei dem der Lipid-/Proteinfilm 30 Minuten lang einem Strom von D2O-gesättigtem Stickstoff ausgesetzt wurde. Die Fläche der Amid-II-Bande (N-H-Biegung, zentriert bei etwa 1550 cm-1) und Amid-I-Bande (C=O-Streckung, zentriert bei etwa 1655 cm-1) wurde durch Peakintegration von 1510 bis 1590 cm-1 ermittelt und 1600 bis 1700 cm−1 Der Anteil der nicht ausgetauschten Reste wurde wie zuvor beschrieben bestimmt [29].

Die Peptidproben wurden in NuPAGE-Probenpuffer mit oder ohne Reduktionsmittel, 5 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP) oder Dithiothreitol (DTT) solubilisiert und auf einem 13,5 %igen Bis-Tris-Gel gemäß dem NuPAGE-Protokoll (Invitrogen) laufen gelassen , Thermo Fisher Scientific). Das Gel wurde mit Coomassie-Blau G-250 gefärbt.

Experimente zur AUC-Sedimentationsgeschwindigkeit (AUC-SV) wurden mit einer analytischen Ultrazentrifuge Beckman ProteomeLab XL-I mit einem Rotor An-50Ti durchgeführt. p7b-Proben wurden in 5 mM Myristylsulfobetain (C14SB, Sigma), 50 mM Tris pH 7,3 und 100 mM NaCl, mit oder ohne Zusatz von 2 mM TCEP und in Gegenwart von 29,4 % (v/v) D2O rekonstituiert, um den Auftrieb des Detergens zu verhindern . Die Proben wurden bei 50.000 U/min in Epon-2-Sektor-Mittelstück-AUC-Zellen mit Quarzfenstern zentrifugiert. Das Absorptionsprofil bei 280 nm wurde 15 Stunden lang alle 10 Minuten erfasst. Sedimentationsprofile wurden in SEDFIT mit dem c(s)-Modell [30] analysiert und mit GUSSI [31] aufgezeichnet. Die S-Werte, die dem Monomer, Dimer oder Tetramer von p7b in C14SB-Mizellen entsprechen, wurden unter Berücksichtigung der Eigenschaften von Detergens, Protein und Pufferzusammensetzung vorhergesagt. Das Molekulargewicht (MW), die Aggregationszahl und das spezifische Volumen des C14SB-Detergens betrugen 363,6 Da, 83–130 (www.anatrace.com) bzw. 0,965–0,978 ml/g (basierend auf unseren Dichteanpassungsdaten). Unter Verwendung der Sequenz von SARS2-7b beträgt das MW 5180 Da und das spezifische Volumen 0,7702 ml/g (berechnet mit der Sednterp-Software). Die Dichte und Viskosität des Puffers (50 mM Tris, 100 mM NaCl und 29,4 % D2O) betrugen ρ = 1,0353 g/ml bzw. η = 1,0997 cP (berechnet mit der Sednterp-Software). Unter der Annahme der niedrigsten Schätzung für die Anzahl der gebundenen Detergensmoleküle und der niedrigsten Schätzung des spezifischen C14SB-Volumens (νD) und des niedrigsten spezifischen Volumens der Mizelle (νc), des Gewichts des Mizellenkomplexes (MC) und des Massenanteils des Detergens (δD) , Auftriebsmasse (Mb) und erwarteter S-Wert können berechnet werden (Tabelle 1). Eine untere Grenze für S für Monomer, Dimer und Trimer kann unter Berücksichtigung der höchsten Aggregationszahl und des waschmittelspezifischen Volumens berechnet werden: 0,13 S, 0,43 S bzw. 0,99 S (letzte Spalte in Tabelle 1).

Experimente zum AUC-Sedimentationsgleichgewicht (AUC-SE) wurden für 7b- und 7b-TM-Proben unter den gleichen Instrumenten-, Rotor- und Pufferbedingungen wie die AUC-SV-Proben durchgeführt. Für jede Probe wurden drei Konzentrationen hergestellt (30, 55 und 100 µM) und bei vier Geschwindigkeiten (23.000, 28.000, 34.500 und 42.000 U/min) in 6-Sektor-Epon-Mittelstück-AUC-Zellen mit Quarzfenstern zentrifugiert. Die Absorption bei 280 nm wurde nach 24-stündiger Äquilibrierung bei jeder Geschwindigkeit gemessen (die Bestätigung des Gleichgewichtsprofils erfolgte nach der Durchführung von Scans in 30-Minuten-Intervallen). Nach Erhalt wurden die Sedimentationsprofile mit verschiedenen Selbstassoziationsmodellen (SEDPHAT) getestet und in GUSSI aufgezeichnet (31, 32).

Das Artenpopulationsdiagramm wurde im Molenbruchmaßstab erstellt, indem die Molenbruchskalen-Assoziationskonstante KX wie beschrieben [33] unter Verwendung des Ausdrucks berechnet wurde: \({K}_{X}={K}_{A,app}\times [Det]\), wobei KA,app die angepasste Assoziationskonstante im molaren Massenmaßstab ist und [Det] die Konzentration des mizellaren Detergens in Lösung ist. Für das Monomer-Dimer-Tetramer-Gleichgewicht wurde der Stoffmengenanteil jeder Spezies in der Detergenzphase: X4, X2 und Methode:

Dabei sind KX,24 und KX,12 die Molenbruchskalen-Assoziationskonstanten für das Dimer-Tetramer- bzw. Monomer-Dimer-Gleichgewicht und Xt der gesamte Proteinmolenbruch in der Detergensphase. Für das Dimer-Tetramer-Gleichgewicht wurden die Stoffmengenanteile auf ähnliche Weise berechnet, indem der folgende Ausdruck nach X2 aufgelöst wurde:

Das dimere Modell von SARS-2 p7b wurde mit dem AlphaFold2-Server [34] (https://colab.research.google.com/github/sokrypton/ColabFold/blob/main/AlphaFold2.ipynb) unter der Annahme einer α-helikalen Struktur erstellt parallele Ausrichtung der Monomere. Der Abstand zwischen den beiden Schwefelatomen zweier TM-Cysteinreste (Cys12) wurde so eingestellt, dass er klein genug ist, um eine Disulfidbindung zu bilden. Um die Ausgangsstrukturen des Tetramers aufzubauen, wurden zwei Möglichkeiten zur Ausrichtung der beiden Homodimere in Betracht gezogen, was zu zwei unterschiedlichen Tetramermodellen führte. Die beiden Dimere wurden um 0,85 nm getrennt, um Kollisionen zu vermeiden, und in eine Lipiddoppelschicht aus 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC) eingebracht. Lipidmoleküle, die enge Kontakte mit dem Proteintetramer bildeten, wurden entfernt. Die Proteinparameter basierten auf dem Kraftfeld AMBER99SB-ILDN [35]. Das verwendete Lipidkraftfeld ist das Slipid, ein rein atomistisches Kraftfeld für biologische Membranen [36, 37]. Das System wurde mit TIP3P-Wassermolekülen [38] solvatisiert und Gegenionen wurden hinzugefügt, um das System zu neutralisieren. Molekulardynamiksimulationen (MD) wurden mit der Software GROMACS [39] 5.1.2 durchgeführt. Der LINCS-Algorithmus [40] wurde verwendet, um Bindungen zwischen Schweratomen und Wasserstoff so einzuschränken, dass ein Zeitschritt von 2 fs möglich ist. Für Berechnungen der Van-der-Waals-Wechselwirkung und der elektrostatischen Wechselwirkung im Nahbereich wurde ein Grenzwert von 1,2 nm verwendet, und für die Berechnung der elektrostatischen Wechselwirkung im Nahbereich wurde die Particle Mesh Ewald-Methode implementiert. Die Simulationstemperatur wurde mit einem V-Rescale-Thermostat [41] bei 300 K und mit einem Parrinello-Rahman-Barostat [42] bei 1 bar Druck gehalten. Simulationen von 100 ns wurden für beide Tetramere in Gegenwart der POPC-Lipiddoppelschicht durchgeführt.

Planare Doppelschichten wurden durch Aneinanderlagerung von zwei Monoschichten gebildet, die aus einer 5 mg/ml-Lösung von reinem 1,2-Diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DPhPC) (Avanti polar lipids, Inc., Alabaster, AL) in Pentan hergestellt wurden. Lipide wurden in eine Öffnung mit einem Durchmesser von ~ 100 μm in der 15 μm dicken Teflontrennwand gegeben, die zwei identische Kammern trennte [43, 44]. Die Öffnung wurde mit einer 3 %igen Lösung von Hexadecan in Pentan vorbehandelt. Wässrige Lösungen bestanden aus 1 M KCl, gepuffert mit 5 mM HEPES bei pH = 6. Alle Messungen wurden bei Raumtemperatur (23 ± 1 °C) durchgeführt. Aktuelle Ereignisse wurden nach Zugabe von 0,5–1 μL einer 2,5 mg/ml-Lösung von SARS-2 p7b in Acetonitril: H2O (1:1 v/v) (ACN 50 %) auf einer Seite der Kammer (cis-Seite) beobachtet. Zusätze wurden in der Nähe der Öffnung durchgeführt und anschließend wurde die Membran neu geformt, um den Proteineinbau in die Lipiddoppelschicht zu fördern. Aufeinanderfolgende Proteinzusätze förderten immer die gleichen aktuellen Ereignisse. Ein elektrisches Potential wurde unter Verwendung von Ag/AgCl-Elektroden in 2 M KCl mit 1,5 % Agarosebrücken angelegt, die in Standard-250-μL-Pipettenspitzen montiert waren. Das Potenzial wurde als positiv definiert, wenn es auf der Seite der Proteinzugabe (cis-Seite) höher war, während die trans-Seite auf Masse gesetzt war. Zur Messung des Stroms und des angelegten Potenzials wurde ein Axopatch 200B-Verstärker (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) im Spannungsklemmenmodus verwendet. Die Daten wurden mit einem integrierten 8-Pol-Bessel-Tiefpassfilter bei 10 kHz gefiltert, mit einer Abtastfrequenz von 50 kHz mit einem Digidata 1440A (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) digitalisiert und mit der Software pClamp 10.7 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) analysiert. CA). Die Kammer und die Kopfstufe wurden mit einem doppelten Metallschirm (Amuneal Manufacturing Corp., Philadelphia, PA) von externen Geräuschquellen isoliert.

Nach der Entfernung der Wassermenge zeigte das Infrarotspektrum von p7b, das in ERGIC-ähnlichen Lipiddoppelschichten rekonstituiert wurde, eine hochsymmetrische und schmale Amid-I-Bande mit der Mitte bei 1656 cm−1, vergleichbar mit dem Spektrum von p7b-TM (Abb. 2). Dies entspricht einer vollständig α-helikalen Konformation. Die Hydratation der Membranen mit D2O erzeugte jedoch ein Spektrum mit einer Schulter um 1.630 cm−1, was auf eine Neigung zur Bildung einer β-Struktur schließen lässt [45], möglicherweise lokalisiert in der C-terminalen Extramembrandomäne. Der Wasserstoff-Deuterium-Austausch (H/D) verringert die Fläche von Amid I, während Amid I konstant bleibt. Aus dem Verhältnis zwischen diesen beiden Bereichen vor und nach der D2O-Zugabe berechneten wir ungefähr 23 Aminosäuren, die gegen den H/D-Austausch resistent sind, was mit einer vorhergesagten einzelnen TM-Domäne übereinstimmt (siehe Abb. 1). Ähnliche Ergebnisse wurden mit SARS p7b erzielt und werden nicht gezeigt.

ATR-FTIR-Absorptionsspektren von SARS-2 p7b, rekonstituiert in ERGIC/Golgi-ähnlichen Lipiddoppelschichten. ATR-FTIR-Spektren von p7b, rekonstituiert in ERGIC-Lipiddoppelschichten, hydratisiert mit H2O (blau) und D2O (rot). Zum Vergleich ist auch das 100 % α-helikale Spektrum von p7b-TM dargestellt (grün)

Da p7b zwei Cysteinreste aufweist, einen in der TMD und einen in der Extramembrandomäne (Abb. 1), haben wir getestet, ob das Migrationsmuster in SDS durch Reduktionsmittel beeinflusst wurde. Unter nicht reduzierenden Bedingungen (− TCEP) wurden mehrere 7b-Oligomere, von Dimeren bis hin zu Tetrameren, beobachtet (Abb. 3, links). Unter reduzierenden Bedingungen (+ TCEP) wurden nur Monomere nachgewiesen (Abb. 3, rechts). Ein ähnliches Muster wurde für SARS 7b beobachtet, wo höhere Oligomere in Gegenwart von DTT verschwanden (Zusatzdatei 1: Abb. S1). Das TMD allein, das nur einen Cysteinrest aufweist, bildete unter den gleichen Bedingungen nur Monomere und Dimere (Zusatzdatei 1: Abb. S1). Dies bestätigt somit das Vorhandensein von Disulfidbindungen in p7b, die möglicherweise einen Einfluss auf die Oligomerisierung haben.

p7b bildet Disulfid-vermittelte Oligomere. SDS-PAGE von SARS-2 p7b ohne TCEP (Spuren 1–3) oder mit TCEP (Spuren 5–7). Die Zahlen geben die verwendeten µg an. Der geschätzte oligomere Zustand wird durch Punkte angezeigt

Das Oligomerisierungsverhalten von p7b wurde mithilfe des Sedimentationsgleichgewichts (SE) weiter untersucht, wobei radiale Verteilungsprofile an verschiedene Selbstassoziationsmodelle angepasst wurden. Bei dieser Technik wird die Dichte der Detergenskomponente der Probe mithilfe von D2O angepasst, und das Verhalten hängt ausschließlich vom Molekulargewicht des Proteinkomplexes und nicht von seiner Form ab. Sedimentationsprofile (Abb. 4A) wurden mit mehreren Modellen angepasst. Nach einer umfassenden Suche wurde die beste Anpassung mit einem Monomer-Dimer-Tetramer-Gleichgewicht (1–2–4), aber auch mit Monomer-Tetramer (1–4) und Dimer-Tetramer (2–4) erzielt. Da Monomere nur in Gegenwart von TCEP in SDS beobachtet wurden (Abb. 3), schlagen wir vor, dass das 2–4-Modell das wahrscheinlichste ist. In Gegenwart von TCEP (Abb. 4B) wurde ein ähnliches Ergebnis beobachtet. Da in SDS eindeutig Monomere beobachtet werden, haben wir in diesem Fall das 1–2–4-Modell gewählt. Die Verteilung dieser Arten in Abhängigkeit vom Protein-zu-Detergens-Verhältnis ist in Abb. 4C dargestellt, berechnet unter Verwendung des zuvor beschriebenen Protokolls [46, 47]. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Tetramerbildung nicht die Anwesenheit von Disulfid-verknüpften Dimeren erfordert, obwohl nicht bekannt ist, ob Tetramere mit oder ohne Disulfidbindungen identisch sind (Tabelle 2).

Sedimentationsgleichgewichtsprofil von SARS-2 p7b im C14SB-Detergens. Ein radiales Multi-Speed-Verteilungsprofil von p7b im C14SB-Reinigungsmittel (Kreise). Die am besten passenden Selbstassoziationsmodelle werden als durchgezogene Linien in den oberen Feldern überlagert und die passenden Residuen werden in den unteren Feldern angezeigt. Das globale reduzierte Chi-Quadrat jedes angepassten Modells wird im Balkendiagramm auf der rechten Seite angezeigt, wobei die Zahlen auf der x-Achse das jeweils angepasste Modell angeben und die besten Modelle gelb hervorgehoben sind; B wie A für p7b in Gegenwart von 2 mM TCEP; Verteilung der C-Monomerpopulation von p7b in oligomeren Spezies, angegeben in Abwesenheit (durchgezogene Linie) und Anwesenheit von TCEP (gepunktete Linie). Die x-Achsen geben die Monomerkonzentration und das Molverhältnis Detergenz/Protein an. Die in SE verwendeten Bedingungen (Bedingungsintervall) sind angegeben

Für 7b-TM waren die besten Anpassungen 1–2, 1–3 und 2–4, aber in Gegenwart von TCEP war Modell 1–2 besser als die anderen beiden, möglicherweise aufgrund der höheren Verfügbarkeit von Monomer in dieser Probe ( Abb. 5A). Letzteres legt nahe, dass die TM-Domäne allein die Dimerisierung auch in Abwesenheit von Disulfidbindungen vorantreiben kann, die Tetramerisierung in p7b-TM (falls vorhanden) jedoch wahrscheinlich die Bildung von Disulfid-verknüpften Dimeren über Cys12 erfordert. Die Unterschiede zwischen den beiden Fällen können auf einen Anstieg der Dimerkonzentration bei der Bildung von Disulfidbindungen oder auf einen günstigeren Wechselwirkungsmodus zwischen den Helices im Dimer zurückzuführen sein. Bei Verwendung des SARS 7b in voller Länge erfordert die Tetramerbildung keine Bildung von Disulfidbindungen (Abb. 5B), und ein Vergleich von SARS p7b TM und p7b in Gegenwart von TCEP legt nahe, dass Monomere im ersten Fall häufiger vorkommen. Insgesamt deutet dies darauf hin, dass (i) ein signifikanter Beitrag zur Stabilität der Extramembrandomänen bei höheren Oligomeren (Tetrameren) vorliegt und (ii) die Helix-Helix-Orientierung im Dimer mit oder ohne Disulfidbindungen gleich sein kann.

Oligomerisierungsmodelle für p7b-TM und SARS p7b im C14SB-Detergens. A Aus den radialen Verteilungsprofilen mit mehreren Geschwindigkeiten von p7b-TM (Zusatzdatei 1: Abb. S2A) wurden am besten angepasste Selbstassoziationsmodelle getestet und das global reduzierte Chi-Quadrat jedes angepassten Modells wird in Abwesenheit angezeigt (-TCEP). ) und Anwesenheit (+ TCEP) von 2 mM TCEP; B Gleiches gilt für SARS p7b (Zusatzdatei 1: Abb. S2B). Die Zahlen auf der x-Achse geben das jeweils verbaute Modell an, die besten Modelle sind gelb hervorgehoben

Obwohl SE der AUC-Goldstandard zur Bestimmung des Molekulargewichts von Membranproteinen ist, deutet die Mehrdeutigkeit der vorgeschlagenen Modelle auf die Verwendung von SV zur Ergänzung der SE-Daten hin. In Abwesenheit des Reduktionsmittels TCEP erzeugte SARS-2 p7b zwei Banden im c(s)-Verteilungsprofil (Abb. 6A), eine bei ~ 0,55 S, was mit der Größe eines Dimers (2-mer) übereinstimmt, und die andere bei 1,1 S im Einklang mit einer tetrameren Form (4-mer). Letzteres stimmt grundsätzlich mit den SE-Ergebnissen überein (Abb. 4). In Gegenwart von TCEP verschwand das vorgeschlagene Tetramer (1,1 S) und die Spezies im unteren S-Bereich verschob sich auf ~ 0,5 S, was immer noch mit einem Dimer übereinstimmt. Wir stellen jedoch fest, dass eine einzelne Bande im c(s)-Diagramm auch auf ein schnelles Gleichgewicht zwischen kleineren und größeren Spezies hinweisen kann [48], daher ist ein schnelles Gleichgewicht zwischen Monomeren, Dimeren und Tetrameren immer noch mit diesen Daten kompatibel. In jedem Fall deutet dies darauf hin, dass die Oligomerisierung nicht unbedingt die Bildung einer Disulfidbindung erfordert. Die Tatsache, dass diese Bande im Vergleich zum Nicht-TCEP-Zustand leicht verschoben ist, lässt darüber hinaus darauf schließen, dass es sich möglicherweise nicht um ein Dimer, sondern um ein schnelles Gleichgewicht zwischen Monomer, Dimer und Tetramer handelt [48]. Somit ergeben sich zwei mögliche Modelle, bei denen ein Tetramer durch zwei Dimere gebildet wird: (i) in einem lösen Disulfidbindungen die Dimerbildung vor der Tetramerbildung aus; (ii) im anderen Fall ist die Wechselwirkung zwischen den Dimeren nichtkovalent, wohingegen Disulfidbindungen zwei Dimere verbinden. Ein ähnliches Muster von Dimeren und Tetrameren wurde auch im Fall von SARS p7b beobachtet (Abb. 6B). Hier war das Ergebnis etwas anders, da sich die größere S-Bande in der „Trimer“-Region befand. Wie oben diskutiert, steht dies wiederum im Einklang mit einer Zwischenspezies, die aus dem schnellen Austausch zwischen Dimeren und Tetrameren resultiert, was die Unterschiede in der Extramembrandomäne zwischen diesen beiden Sequenzen widerspiegelt und weiter unterstützt, dass die Extramembrandomäne an der Bildung dieser Oligomere beteiligt ist.

Sedimentationsgeschwindigkeitsprofil von SARS-2 und SARS p7b im C14SB-Reinigungsmittel. (A) Vergleich der c(s)-Verteilung mit (rot) oder ohne Reduktionsmittel TCEP (schwarz). Graue Rechtecke zeigen den Bereich der S-Werte an, die für ein p7b-Monomer, -Dimer und -Tetramer berechnet wurden (siehe Abschnitt „Methoden“). (B) Gleiches gilt für SARS p7b

Wir haben in AlphaFold Dimere erzeugt, die durch Cys 12 verknüpft sind, und keines dieser tetrameren Modelle (Abb. 7) erzeugte eine mit einem Kanal kompatible Struktur (https://mole.upol.cz/).

Modelle des 7b-TM-Homotetramers. A–B Zwei tetramere Modelle, erhalten durch Wechselwirkung zweier Disulfid-verknüpfter Dimere (gelb). Die Dimere wurden mit Alpha-Fold erhalten, während das Tetramer in eine POPC-Membran eingebettet war; C Der Porendurchmesser erreicht bei beiden Modellen an mehreren Stellen entlang des Kanals Null (unteres Bild).

Die planare Membranelektrophysiologie wurde verwendet, um die Fähigkeit von SARS-2 p7b in voller Länge zu testen, Kanäle in Lipiddoppelschichten zu bilden. Die Zugabe des in ACN 50 % verdünnten Proteins induzierte nur gelegentlich große instabile Ströme, die über Minuten anhielten und schrittweise Stromübergänge aufwiesen (Abb. 8). Im Allgemeinen verursachten diese Ströme keinen Membranbruch. Eine durch p7b induzierte Stromaktivität wurde bei angelegten Spannungen im Bereich von ± 10 bis ± 100 mV beobachtet. Kontrollexperimente mit ACN 50 % allein zeigten keine Wirkung auf die Membran. Die während p7b-induzierten Membranpermeabilisierungsereignissen gemessene Leitfähigkeit (G = I/V) betrug mehrere Nano-Siemens mit typischen Leitfähigkeitsschritten von 1–5 nS (Abb. 8). Solche hohen Leitfähigkeiten sind vergleichbar mit denen, die in breiten Porinen mit Durchmessern von 1–2 nm gemessen werden [49, 50]. Die bei p7b-induzierten Strömen beobachtete Instabilität ähnelt jedoch nicht der von Porinen oder anderen kanalbildenden Proteinen wie dem SARS-CoV-2-E-Protein [51], die leisere Ströme zeigen. Eine Erklärung für das Auftreten solch großer transienter Stromstärken – möglicherweise im Zusammenhang mit einem hohen Protein/Lipid-Verhältnis, das eine waschmittelähnliche Wirkung begünstigt [52] – liegt außerhalb des Rahmens der vorliegenden Arbeit. Somit beweist die beobachtete p7b-induzierte Doppelschichtpermeabilisierung, dass das Protein mit Lipidmembranen interagiert, ist jedoch kaum mit der Existenz echter Ionenkanäle vereinbar, die auf einer tetrameren Anordnung mit mehreren hydrophoben Resten basieren, die die enge Pore auskleiden.

Gelegentliche Permeabilisierung der Lipidmembran durch p7b. Repräsentative Stromaufzeichnungen mit angelegter Spannung + 100 mV nach Zugabe von p7b zu planaren DPhPC-Lipidmembranen. Die Aufnahmen wurden digital mit einem 8-poligen Bessel-Tiefpassfilter mit einer Grenzfrequenz von 500 Hz gefiltert

Die genaue Rolle der von SARS-CoVs kodierten gruppenspezifischen akzessorischen Proteine ​​während der Infektion ist noch nicht vollständig geklärt. Da die SARS-CoV-Genome jedoch die größte Anzahl akzessorischer Proteine ​​unter den Coronaviren kodieren, ist es verlockend zu spekulieren, dass sie eine wichtige Rolle bei der klinischen Manifestation einer Infektion spielen. SARS-CoV 3a, 6, 7a und 7b haben Transmembrandomänen [18, 26, 53, 54]. 7a weist eine hohe strukturelle Ähnlichkeit mit den Proteinen der Ig-ähnlichen Superfamilie auf, obwohl keine signifikante Sequenzhomologie besteht [55, 56], wohingegen 3a tetramere Ionenkanäle bildet [57] mit einer Struktur in Lipid-Nanoscheiben, die kürzlich mithilfe von Kryo-EM gelöst wurde [58]. In der vorliegenden Studie haben wir das Verhalten von p7b sowohl in Lipid- als auch in Detergensumgebungen untersucht, um festzustellen, ob es Oligomere mit Ionenkanaleigenschaften bildet. Insgesamt ist die Schlussfolgerung aus unseren Daten, dass p7b überwiegend α-helikal ist, obwohl die Extramembrandomäne einige β-Stränge bilden kann. Diese letztere Domäne trägt wahrscheinlich zur Stabilität der Oligomere bei.

Obwohl in SDS Oligomere beobachtet werden, ist dieses starke Detergenz keine geeignete Umgebung für die Untersuchung des Aufbaus von α-Helices. Es ist jedoch klar, dass in Abwesenheit von Reduktionsmittel keine Monomere vorhanden sind. Dadurch werden Modelle mit Monomeren eliminiert, wenn SE-Sedimentationsprofile angepasst werden, die das mildere Reinigungsmittel C14SB verwenden. Daher schlagen wir vor, dass das wahrscheinlichste Modell ein Gleichgewicht zwischen Dimeren und Tetrameren ist. Bei Anwesenheit eines Reduktionsmittels wurden in SDS nur Monomere beobachtet, und auch in SV-Experimenten wurden deutliche Veränderungen beobachtet. Dies bestätigt, dass in der Probe Disulfidbindungen vorhanden sind und dass die Zerstörung dieser Bindungen die Oligomerisierung beeinflusst, die Bildung von Tetrameren jedoch nicht verhindert, da das beste Modell in AUC SE 1–2–4 ist. Hier kann das Modell durch zwei Arten von Dimeren (verknüpft oder nicht durch Disulfidbindungen verbunden), einen geringen Beitrag von Trimeren oder größeren Oligomeren, einen Beitrag von TCEP selbst usw. kompliziert werden. Wir sind jedoch der Meinung, dass es den Rahmen dieser Arbeit sprengt, ein solch komplexes Verhalten weiter zu charakterisieren.

Obwohl die Beteiligung von Disulfidbindungen an der Oligomerisierung, aber nicht deren Erfordernis, an die des M2-Protonenkanals des Influenzavirus A erinnert, wurde in keinem der vorgeschlagenen tetrameren Modelle ein Porenweg nachgewiesen. Darüber hinaus wird dies experimentell gestützt, da die in Standarddoppelschichten nachgewiesene elektrische Aktivität nicht mit einer sehr engen tetrameren Pore übereinstimmte, was darauf hindeutet, dass p7b keine echten Ionenkanäle bildet. Insgesamt deutet das Vorhandensein von DTT-resistentem Dimer in der Gelelektrophorese und in SE-Experimenten in Gegenwart eines Reduktionsmittels darauf hin, dass die Dimerisierung keine Bildung einer Disulfidbindung erfordert, obwohl letztere sie stabilisieren kann. In einem ähnlichen System wurde vermutet, dass der Cysteinrest in der ζζ-Transmembrandomäne die dimere Form erst nach Bildung der richtigen Grenzfläche stabilisiert [59]. Insgesamt ist die Rolle, die p7b im viralen Lebenszyklus und während der Infektion mit SARS-CoV spielt, noch unklar, wir geben jedoch einen ersten Einblick in sein oligomerisierendes Verhalten.

Die Daten werden auf begründete Anfrage an den entsprechenden Autor weitergegeben.

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MQ und VA bedanken sich für die Unterstützung der spanischen Regierung MCIN/AEI/http://dx.doi.org/10.13039/501100011033 (Projekt-Nr. 2019-108434GB-I00 AEI/FEDER, UE und IJC2018-035283-I/AEI) und Universitat Jaume I (Projektnr. UJI-A2020-21). Wir danken Siok Wan Gan und Cin Huang Soon für die Reinigung von SARS p7b und p7b-TM.

„Diese Forschung wird vom Bildungsministerium von Singapur im Rahmen seines Academic Research Fund Tier 1 (Projekt RG92/21) an JT unterstützt.) MQ und VA bedanken sich für die Unterstützung der spanischen Regierung MCIN/AEI/ http://dx.doi.org/10.13039/501100011033 (Projekt-Nr. 2019-108434 GB-I00 AEI/FEDER, UE und IJC2018-035283-I/AEI ) und Universitat Jaume I (Projektnr. UJI-A2020-21).

School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, 60 Nanyang Drive, Singapur, 637551, Singapur

Wahyu Surya, Yuguang Mu und Jaume Torres

Labor für Molekulare Biophysik, Fachbereich Physik, Universität Jaume I, 12080, Castelló, Spanien

Maria Queralt-Martin & Vicente M. Aguilella

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WS reinigte die Peptide und führte die meisten Experimente durch, analysierte die Daten und trug zum Verfassen des Manuskripts bei; MQ führte die Kanalaktivitätsexperimente durch und MY führte die Simulation durch. VA trägt zur Kanalanalyse und zum Verfassen des Manuskripts bei. JT konzipierte das Projekt, analysierte Daten und verfasste das Manuskript. Alle Autoren stimmten dem endgültigen Manuskript zu.

Korrespondenz mit Jaume Torres.

Unzutreffend.

Alle Autoren haben das Manuskript vor der Einreichung überarbeitet.

Alle Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

SDS-PAGE-Elektrophorese von SARS-1 p7b-TM und p7b, mit oder ohne DTT. Die Peptide wurden einer SDS-PAGE unter Verwendung von 16,5 % vorgegossenem Tricin-Gel (Bio-Rad) mit oder ohne 1,4-Dithiothreitol (DTT) unterzogen. Dem lyophilisierten Peptid wurde SDS-Probenpuffer bis zu einer Endkonzentration von 2 μg/ul zugesetzt. Die Probe wurde 1 Minute lang mit Probenpuffer gemischt und anschließend 5 Minuten lang auf 95 °C erhitzt, bevor sie auf das Gel geladen wurde. Das Gel wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur bei einer konstanten Spannung von 80 V betrieben. Die Molekularmassenmarker wurden von Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) bezogen. Das Gel wurde mit Coomassie-Blau gefärbt. Die linken Spuren sind p7b-TM; Spur 3 ist ein Molekularmassenmarker; Spuren 4–5 sind p7b. Abb. S2. Sedimentationsgleichgewichtsprofil von SARS1 7b-TM und 7b im C14SB-Detergens. Ein radiales Verteilungsprofil von 7b-TM in C14SB bei 28.000 U/min (rote Kreise), 34.500 U/min (grüne Kreise) und 42.000 U/min (blaue Kreise). Das Vorhandensein von TCEP wird in den entsprechenden Feldern angezeigt. Die am besten passenden Selbstassoziationsmodelle werden als durchgezogene Linien in den oberen Feldern überlagert und die passenden Residuen werden in den unteren Feldern angezeigt. Das am besten geeignete Modell für 7b-TM ohne TCEP war ein Dimer-Tetramer, wohingegen es mit TCEP ein Monomer-Dimer war; B Das Gleiche wie A für SARS1 7b, wobei das am besten geeignete Modell ein Monomer-Dimer-Tetramer mit oder ohne TCEP war. Wir stellen fest, dass die Anpassungsresiduen manchmal selbst im am besten angepassten Modell nicht zufällig verteilt sind. Dies weist darauf hin, dass noch eine kleine Menge anderer Spezies unberücksichtigt bleiben könnte, möglicherweise Zwischenspezies (z. B. Trimer) oder Oligomere höherer Ordnung (z. B. Octamer), die zu komplex sind, um sie neben dem Dimer und Tetramer zu modellieren

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Nachdrucke und Genehmigungen

Surya, W., Queralt-Martin, M., Mu, Y. et al. Das akzessorische SARS-CoV-2-Protein 7b bildet im Waschmittel Homotetramere. Virol J 19, 193 (2022). https://doi.org/10.1186/s12985-022-01920-0

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Eingegangen: 21. September 2022

Angenommen: 04. November 2022

Veröffentlicht: 21. November 2022

DOI: https://doi.org/10.1186/s12985-022-01920-0

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