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Jun 25, 2023

Bei Schweinen wurden hochtödliche rekombinante Afrikanische Schweinepestviren der Genotypen I und II nachgewiesen

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 3096 (2023) Diesen Artikel zitieren 4418 Zugriffe 17 Altmetric Metrics-Details Das Afrikanische Schweinepestvirus (ASFV) stellt eine große Bedrohung für das globale Schwein dar

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 3096 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Das Afrikanische Schweinepestvirus (ASFV) stellt eine große Bedrohung für die weltweite Schweineindustrie und die Ernährungssicherheit dar. Derzeit wurden 24 ASFV-Genotypen gemeldet, es ist jedoch unklar, ob in der Natur eine Rekombination verschiedener Genotyp-Viren auftritt. In dieser Studie erkennen wir drei Rekombinanten von ASFVs der Genotypen I und II bei Schweinen in China. Diese Rekombinanten sind genetisch ähnlich und werden aufgrund ihres B646L-Gens als Genotyp I klassifiziert, doch 10 einzelne Fragmente, die über 56 % ihres Genoms ausmachen, stammen vom Genotyp-II-Virus. Tierstudien mit einem der rekombinanten Viren weisen auf eine hohe Letalität und Übertragbarkeit bei Schweinen hin, und die Deletion der Virulenz-bezogenen Gene MGF_505/360 und EP402R, die vom virulenten Genotyp-II-Virus stammen, schwächt dessen Virulenz stark ab. Der abgeschwächte Lebendimpfstoff, der vom ASFV des Genotyps II stammt, schützt nicht vor der Belastung durch das rekombinante Virus. Diese natürlich vorkommenden Rekombinanten von ASFVs des Genotyps I und II könnten eine Herausforderung für die globale Schweineindustrie darstellen.

Die Afrikanische Schweinepest (ASF) ist eine verheerende Infektionskrankheit bei Schweinen, die eine ernsthafte Bedrohung für die globale Schweineindustrie darstellt (www.woah.org). ASF-Viren (ASFVs) gehören zur Gattung Asfivirus und zur Familie der Asfarviridae1,2. Das ASFV-B646L-Gen kodiert für das virale Kapsidprotein P72, das eine wesentliche Rolle beim Virionaufbau und der Virusanheftung an die Wirtszelle spielt1,3. ASFVs werden basierend auf der C-terminalen Sequenz ihres B646L-Gens mit einer Nukleotididentität von 86,2–99,5 % in 24 Genotypen unterteilt4. Alle 24 ASFV-Genotypen wurden in Afrika südlich der Sahara nachgewiesen, und nur zwei dieser Genotypen haben sich außerhalb Afrikas verbreitet2,5. Im Jahr 1957 wurde ASPV vom Genotyp I in Europa eingeschleppt und verursachte ASP-Ausbrüche in vielen europäischen Ländern6. Im Jahr 2007 trat in Georgien ein äußerst tödliches ASFV vom Genotyp II (Georgia07) auf, das sich schnell in die Nachbarländer ausbreitete (www.woah.org). Im Jahr 2018 verbreitete sich der georgische07-ähnliche ASPV nach China und in andere asiatische Länder7 und ist seitdem für den Verlust von über sieben Millionen Schweinen in eurasischen Ländern verantwortlich (www.woah.org).

Schweine sind nicht gegen ASP geimpft; Aufgrund des Fehlens einer wirksamen Kontrollstrategie ist ASFV daher weit verbreitet und entwickelt sich in vielen Ländern weiter8,9. Seit 2018 überwachen wir aktiv die genetischen und biologischen Veränderungen des Virus in China. Im Jahr 2020 wurden in China mehrere Varianten von Genotyp-II-Viren mit verringerter Pathogenität bei Schweinen entdeckt. Diese verringerte Pathogenität wurde auf Mutationen und Deletionen in ihren Genomen zurückgeführt, die zu einer Störung der Expression des CD2v-Proteins führten, einem wichtigen Virulenzfaktor der Schweine Genotyp II ASFV10,11. Wir fanden außerdem heraus, dass im Jahr 2021 in China schwach virulente ASFVs des Genotyps I bei Schweinen auftraten12, und dass die Stämme keine Hämadsorption aufwiesen (HAD-negativ) und dem in den 1960er Jahren in Portugal gemeldeten NH/P68-Stamm genetisch ähnlich waren13. Sowohl Genotyp-I- als auch Genotyp-II-ASFVs wurden bei Schweinen in China gefunden. Daher fragten wir: Ist es möglich, dass diese Viren in der Natur rekombinieren? Und wenn ja, welche Herausforderungen werden die rekombinanten Stämme mit sich bringen?

Hier haben wir drei Rekombinanten von ASFVs der Genotypen I und II auf Feldern in China isoliert. Die Rekombinanten wurden hinsichtlich ihrer Genome vollständig charakterisiert und ihre Virulenz und Immunfluchtfähigkeit wurden an Schweinen getestet. Die Ergebnisse zeigten die schnelle Entwicklung von ASFVs durch genomische Rekombination zwischen verschiedenen Genotypen, was eine neue Herausforderung für die Bemühungen zur Krankheitsbekämpfung und die Impfstoffentwicklung darstellt.

Während unserer Überwachung in China haben wir drei ASFVs aus Schweineproben isoliert, die jeweils in der Provinz Jiangsu, der Provinz Henan und der Autonomen Region Innere Mongolei gesammelt wurden, und sie als Pig/Jiangsu/LG/2021 (JS/LG/21), Pig/Henan bezeichnet /123014/2022 (HeN/123014/22) bzw. Pig/Inner Mongolia/DQDM/2022 (IM/DQDM/22). Wir haben diese Stämme anhand ihrer B646L-Gensequenz als Genotyp I identifiziert (ergänzende Abbildung 1). Wir waren jedoch überrascht, als wir feststellten, dass diese Viren alle HAD-positiv sind (ergänzende Abbildung 2), da die zuvor in China entdeckten Viren des Genotyps I alle HAD-negativ waren12. Der HAD-positive Phänotyp von ASFV wird hauptsächlich durch die Integrität des CD2v-Proteins bestimmt, das vom EP402R-Gen14 kodiert wird. Wir haben daher das EP402R-Gen dieser drei Viren sequenziert und festgestellt, dass ihre EP402R-Gene zu 100 % mit denen des HLJ/18-Virus, dem ersten Genotyp-II-Isolat in China, identisch sind15,16, aber nur zu 81 % mit denen von das in China nachgewiesene Genotyp-I-Virus SD/DY-I/2112.

Anschließend führten wir eine Next-Generation-Sequenzierung der B646L- und EP402R-Gene aus den Feldproben sowie gereinigten Virusbeständen durch. Die PCR-Amplifikation für die B646L- und EP402R-Gene wurde in den T-Vektor pMD19 kloniert und 20 positive Klone für jede Reaktion wurden zufällig für die Sequenzierung mithilfe der Sanger-Sequenzierungsmethode ausgewählt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das B646L-Gen und das EP402R-Gen dieser neu auftretenden Viren vom Genotyp-I-Virus bzw. Genotyp-II-Virus stammen.

Um die genomische Zusammensetzung dieser Viren weiter zu untersuchen, haben wir ihre gesamten Genome (GenBank-Zugangsnummern: OQ504954 für HeN/123014/22, OQ504955 für IM/DQDM/22 und OQ504956 für JS/LG/21) mithilfe von Primern amplifiziert und sequenziert wie zuvor in Lit. beschrieben. 16 und benachbarte PCR-Amplifikationssegmente teilen sich eine Überlappung von 100–200 Basenpaaren (bps), um die von den Primern generierten Sequenzen abzudecken. Anschließend führten wir eine phylogenetische Analyse der drei Viren und 56 Referenzviren der acht verschiedenen Genotypen durch, die in GenBank verfügbar sind. Die Länge der Genome von JS/LG/21, HeN/123014/22 und IM/DQDM/22 beträgt 185.431, 185.395 bzw. 185.342 bps und jedes von ihnen verfügt über 172 offene Leserahmen (ORFs). Die drei neu auftretenden Viren haben auf Nukleotidebene eine Homologie von 99,97–99,99 % miteinander und bilden einen einzigartigen Zweig im phylogenen Baum, der sich zwischen den Viren des Genotyps I und II ansammelt (Abb. 1a).

a Der phylogenetische Baum wurde mithilfe des Maximum Likelihood (ML) und des IQ-Baums basierend auf den vollständigen Genomsequenzen der drei rekombinanten ASFVs und 56 Referenz-ASFVs von acht verschiedenen Genotypen aus der GenBank-Datenbank erstellt. b Spezifische Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) an den Verbindungsregionen zweier rekombinanter Fragmente. Die gesamten Genome von drei rekombinanten ASFVs wurden mithilfe der SnapGene-Software mit denen des repräsentativen NH/P68-ähnlichen Genotyps I ASFV SD/DY-I/21 und des Georgia07-ähnlichen Genotyps II ASFV HLJ/18 verglichen. Die vom Genotyp I ASFV abgeleiteten rekombinanten Fragmente sind blau markiert, die vom Genotyp II ASFV abgeleiteten Fragmente rosa. c Das Diagramm des rekombinanten ASFV wurde mit dem BLAST Ring Image Generator mit der gesamten Genomsequenz von JS/LG/21 erstellt.

ASFVs vom Georgia07-ähnlichen Genotyp II und NH/P68-ähnlichen Genotyp I wurden auf Feldern in China nachgewiesen12,15,16,17. Ihre jeweiligen Vertreter sind das Genotyp-II-Virus HLJ/18 (GenBank: MK333180) und das Genotyp-I-Virus SD/DY-I/21 (GenBank: MZ945537), die eine Nukleotididentität von 97,38 % aufweisen12,16. Verglichen mit dem von SD/DY-I/21 weist das Genom von HLJ/18 21.062 bp-Insertionen, 4237 bp-Deletionen und 3840 bp-Mutationen auf. Beide Viren weisen genotypspezifische Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) in den kodierenden und nichtkodierenden Regionen ihres Genoms auf (Abb. 1b). Um die Genome der drei rekombinanten ASFVs zu charakterisieren, führten wir eine Rekombinationsanalyse durch, um die wahrscheinlichen Eltern der verschiedenen Fragmente der Rekombinanten basierend auf den spezifischen SNPs der ASFVs des Genotyps I und II zu bestimmen. Ein detaillierter Vergleich ergab, dass zehn große diskrete Genomfragmente der neuen Viren vom Genotyp-I-Virus stammen (Abb. 1c), was durch die Tatsache belegt wird, dass diese Fragmente Genotyp-I-spezifische SNPs (Abb. 1b) mit einer Identität von 99,36–100 % aufweisen mit den homologen Genomfragmenten von SD/DY-I/21, aber 71,28–99,15 % Identität mit denen von HLJ/18 (Tabelle 1 und Ergänzungstabelle 1). Die anderen zehn diskreten Genomfragmente der neuen Viren stammen vom Genotyp-II-Virus (Abb. 1c), da sie Genotyp-II-spezifische SNPs (Abb. 1b) und eine Identität von 99,95–100 % mit den homologen Genomfragmenten von HLJ/18 aufweisen. aber 27,50–98,32 % Identität mit denen des SD/DY-I/21 (Tabelle 1 und Ergänzungstabelle 1). Die Gesamtlänge der zehn Fragmente in den drei neu auftretenden Viren, die vom Genotyp-I-Virus abgeleitet sind, liegt zwischen 80.648 und 80.737 bps, was 43,51–43,54 % ihres Genoms ausmacht, während die Gesamtlänge der zehn Fragmente in den drei neu auftretenden Viren, die vom Genotyp-II-Virus abgeleitet sind, 104.694 bps beträgt, was 56,46–56,49 % ihres Genoms ausmacht (Tabelle 1 und Ergänzung). Tabelle 1). Bemerkenswert ist, dass sich das genotypbestimmende Gen B646L aller drei neu auftretenden Viren in Fragment 9 (F9) befindet, das vom Genotyp-I-Virus stammt, während sich das für CD2v kodierende EP402R-Gen in Fragment 6 (F6) befindet, das vom Genotyp-II-Virus stammt ( Abb. 1c); Dies erklärt, warum die neuartigen Viren des Genotyps I den HAD-positiven Phänotyp aufweisen. Informationen zu den rekombinanten Fragmenten und allen ORFs der drei Rekombinanten sind im Ergänzungsdatensatz 1 aufgeführt. Diese Ergebnisse zeigen somit, dass es sich bei den drei neu auftretenden Viren um komplizierte Rekombinanten mit Mosaikgenomen von ASFVs des Genotyps I und Genotyp II handelt.

Unsere vorherige Studie ergab, dass bei ASFVs häufig Nukleotidmutationen, -insertionen und -deletionen aufgetreten sind und einige Änderungen zu einer Veränderung der ORFs geführt haben11,12,16. Wir verglichen daher die Genome der drei neu auftretenden Viren mit denen von SD/DY-I/21 und HLJ/1812,15,16. Im Vergleich zu homologen Fragmenten von SD/DY-I/21 weisen die drei Rekombinanten alle acht einzelne Nukleotidmutationen in sechs ORFs in vier verschiedenen Fragmenten, eine 96-nukleotide Fragmentinsertion im ORF von B602L und eine einzelne Nukleotidmutation, zwei einzelne, auf Nukleotid-Deletionen und eine 3-Nukleotid-Deletion in der nichtkodierenden Region in F1 (Abb. 2a, b). JS/LG/21 und HeN/123014/22 haben beide eine C-Deletion in MGF_110-13/14L. Darüber hinaus weist JS/LG/21 eine einzigartige Einzelnukleotidmutation und eine 36 Nukleotid lange Deletion in den kodierenden Regionen auf. HeN/123014/22 weist drei einzigartige Einzelnukleotidmutationen in drei ORFs auf, und IM/DQDM/22 weist eine Einzelnukleotidmutation im ORF von MGF_505-7R auf (Abb. 2a, b).

Nukleotidmutationen, -deletionen und -insertionen in den drei rekombinanten ASFVs im Vergleich zu den entsprechenden Regionen des Genotyp-I-Virus SD/DY-I/21 (a, b) und des Genotyp-II-Virus HLJ/18 (c, d) in den OFRs (a , c) und die nichtkodierenden Regionen (b, d).

Verglichen mit der homologen Genomsequenz von HLJ/18 weisen die drei Rekombinanten die gleiche Einzelnukleotidmutation und zwei Einzelnukleotidinsertionen in drei ORFs auf (Abb. 2c). JS/LG/21 weist eine einzigartige Einzelnukleotidmutation im ORF von MGF_100-1L auf. HeN/123014/22 weist vier einzigartige Einzelnukleotidmutationen in vier ORFs und fünf einzigartige Einzelnukleotidmutationen in den nichtkodierenden Regionen in F20 auf (Abb. 2c, d). IM/DQDM/22 weist eine einzigartige Einzelnukleotidmutation im ORF von C475L auf (Abb. 2c).

Die Nukleotidinsertionen und -deletionen in den vom Genotyp-I-Virus abgeleiteten Genomfragmenten führen im Vergleich zu zur Veränderung eines ORF des rekombinanten IM/DQDM/22-Virus und zweier ORFs der rekombinanten JS/LG/21 und HeN/123014/22 das SD/DY-I/2-Virus (Ergänzungstabelle 2) und die Nukleotidinsertionen in den vom Genotyp-II-Virus abgeleiteten Genomfragmenten führen zu einer Veränderung von zwei ORFs der drei rekombinanten Viren im Vergleich zum HLJ/18-Virus (Ergänzungstabelle 2). Tisch 3).

Die zehn diskreten Fragmente des hochvirulenten Genotyp-II-Virus in den neuen rekombinanten Viren tragen 106 ORFs (Abb. 1 und ergänzender Datensatz 1). Bemerkenswert ist, dass einige dieser Gene Virulenzdeterminanten sind, wie zum Beispiel das EP402R-Gen und die sechs Gene in der MGF_505/360-Region (MGF_505-1R, MGF_505-2R, MGF_505-3R, MGF_360-12L, MGF_360-13L und MGF_360). 14L) (wir bezeichnen diese sechs Gene in diesem Bericht als „MGF_505/360-Gene“)11,18,19. Um zu untersuchen, ob die Gene des tödlichen Genotyp-II-Virus zur Pathogenität und Übertragbarkeit des rekombinanten ASFV beitragen, wurden Gruppen von sechs 7 Wochen alten spezifisch pathogenfreien (SPF) Schweinen mit 103 HAD50 oder 106 HAD50 JS/ LG/21. Zwei nicht inokulierte Schweine wurden zusammen mit jeder Gruppe inokulierter Schweine gehalten, um die Virusübertragbarkeit zu bewerten. Die Schweine wurden täglich auf klinische Anzeichen überwacht. Allen Schweinen wurden ab Tag 3 nach der Inokulation (pi) jeden zweiten Tag orale und rektale Abstriche sowie Blut entnommen, um mittels qPCR eine Virusausscheidung und Virämie festzustellen.

In der 106 HAD50-Gruppe begannen alle sechs geimpften Schweine am 4. Tag pi Fieber zu bekommen und starben zwischen Tag 5 pi und Tag 8 pi (Abb. 3). Die beiden Kontaktschweine begannen am 9. Tag nach dem Kontakt Fieber zu bekommen (p.ct.) und beide starben am 12. Tag p.ct. (Abb. 3). In den Mundabstrichen, Rektalabstrichen und im Blut aller geimpften Schweine und Kontaktschweine wurde virale DNA nachgewiesen (Abb. 3). Auch in den Organen, darunter Gehirn, Herz, Leber, Milz, Lunge, Niere und Mandeln, sowie in drei verschiedenen Lymphknoten (inguinaler Lymphknoten, submaxillärer Lymphknoten und mediastinaler Lymphknoten) wurden hohe Mengen viraler DNA nachgewiesen tote Schweine (Abb. 3). In der 103 HAD50-Gruppe entwickelten die geimpften Schweine am Tag 4 pi Fieber und alle Schweine starben zwischen Tag 6 pi und Tag 15 pi (Abb. 3). Die beiden Kontaktschweine begannen am 9. Tag Fieber zu entwickeln. bzw. Tag 10 Prozent; einer starb am 12. Tag. und der andere starb am 14. Tag. (Abb. 3). Virale DNA wurde auch in den Mund- und Rektalabstrichen, im Blut und in allen Organen aller geimpften Schweine und Kontaktschweine nachgewiesen, obwohl die Werte etwas niedriger waren als die der 106 HAD50-Gruppe (Abb. 3). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das rekombinante Virus JS/LG/21 bei Schweinen hochgradig tödlich und übertragbar ist.

Gruppen von sechs SPF-Schweinen wurden mit 106 HAD50 (a–f) oder 103 HAD50 (g–l) JS/LG/21 geimpft, und zwei naive SPF-Schweine wurden vom ersten Tag der Inokulation an mit jeder Gruppe zusammen gehalten. Die Rektaltemperatur (a, g) und das Überleben der Schweine (b, h) wurden täglich überwacht. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurden orale Abstriche (c, i), rektale Abstriche (d, j) und Blut (e, k) entnommen, und Gewebeproben (f, l) wurden von toten Schweinen zum Nachweis viraler DNA mittels qPCR entnommen. Die gestrichelten schwarzen Linien zeigen die normale Rektaltemperatur (40 °C) von Schweinen. LN1, inguinaler Lymphknoten; LN2, submaxillärer Lymphknoten; LN3, mediastinaler Lymphknoten. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Es wurde gezeigt, dass viele Gene für die Virulenz von ASFV wichtig sind (Ergänzungstabelle 4). Frühere Studien legen nahe, dass MGF_505/360 und EP402R wichtige Virulenzfaktoren für ASFVs der Genotypen I und II sind10,18,19. Die NH/P68-ähnlichen Viren des Genotyps I zeigen bei Schweinen eine geringe Virulenz12,20, wohingegen Georgia07-ähnliche Viren des Genotyps II für Schweine äußerst tödlich sind15,19. Die Genome der drei rekombinanten Isolate stammen zu 43,5 % aus Fragmenten vom NH/P68-ähnlichen Genotyp-I-Virus und zu 56,5 % vom Georgia07-ähnlichen Genotyp-II-Virus. Allerdings zeigte das rekombinante Isolat die gleiche Letalität wie das Georgia07-ähnliche Genotyp-II-Virus bei Schweinen. Die Gene MGF_505/360 und EP402R sind bei NH/P68-ähnlichen Viren von Natur aus defekt21,22. In dieser Studie enthalten alle drei rekombinanten Isolate die MGF_505/360-Gene und das EP402R-Gen, die vom äußerst tödlichen Georgia07-ähnlichen Genotyp-II-Virus stammen.

Um zu bestimmen, wie sich diese MGF_505/360- und EP402R-Gene auf die Virulenz der rekombinanten Isolate auswirken, haben wir das rekombinante JS/LG/21 mit der Deletion von EP402R, MGF_505-1R, MGF_505-2R, MGF_505-3R, MGF_360-12L, MGF_360 generiert. 13L- und MGF_360-14L-Gene und ersetzte diese Gene mithilfe der homologen Rekombination durch die Venus- und mCherry-Gene. Das resultierende Virus wurde als JS/LG/21-7GD entworfen (Abb. 4a). JS/LG/21-7GD hatte in PAMs eine ähnliche Wachstumsdynamik wie sein Elternvirus JS/LG/21 (Abb. 4b), und die Fluoreszenz von Venus und mCherry wurde bei 72 mit JS/LG/21-7GD infizierten PAMs beobachtet h nach der Infektion (Abb. 4c). Wir haben die Pathogenität von JS/LG/21-7GD bei SPF-Schweinen durch intramuskuläre Inokulation mit einer Dosis von 106 TCID50 getestet. Alle zehn geimpften Schweine hatten kein Fieber und keine ASFV-bedingten klinischen Symptome (Abb. 4d), überlebten den 28-tägigen Beobachtungszeitraum (Abb. 4e) und entwickelten erhebliche Mengen an ASFV-spezifischen Antikörpern (Abb. 4f). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die MGF_505/360-Gene und das EP402R-Gen des Genotyp-II-Virus wichtige Virulenzfaktoren für JS/LG/21 sind.

a Schematische Darstellung des gendeletierten JS/LG/21-7GD. Die gelöschten Gensegmente wurden wie angegeben durch die Reportergenkassetten p72mCherry und p72Venus ersetzt. Angegeben sind Nukleotidpositionen, die die Grenzen der Deletion relativ zum ASFV JS/LG/21-Genom angeben. b Wachstumskurve von JS/LG/21 und JS/LG/21-7GD in PAMs. PAMs wurden mit JS/LG/21 bzw. JS/LG/21-7GD bei einer MOI von 0,1 infiziert. Die Überstände wurden aus drei Vertiefungen zum Nachweis viraler DNA mittels qPCR zu den angegebenen Zeitpunkten gesammelt. Die Daten wurden als Mittelwerte ± SD dargestellt. c Fluoreszenz von mit JS/LG/21-7GD infizierten PAMs 72 Stunden nach der Inokulation. Dieses Experiment wurde dreimal durchgeführt und die Daten eines unabhängigen Experiments wurden gezeigt. Zehn SPF-Schweine wurden mit 106 TCID50 von JS/LG/21-7GD geimpft. Rektaltemperatur (d) und Überleben (e) wurden 28 Tage lang nach der Infektion täglich überwacht. f Seren wurden von zehn inokulierten Schweinen zu den angegebenen Zeitpunkten für den ASFV-spezifischen Antikörpernachweis mithilfe eines blockierenden ELISA-Kits (hausintern) gesammelt. Die Daten wurden als Mittelwerte ± SD dargestellt. Die gestrichelten schwarzen Linien zeigen die normale Rektaltemperatur (40 °C) von Schweinen. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Frühere Studien haben gezeigt, dass sich bei Schweinen, die eine niedrigvirulente ASFV-Infektion überleben, eine schützende Immunität entwickelt, die eine Resistenz gegen die Belastung durch homologe Viren, jedoch nicht gegen die Belastung durch heterologe Viren bietet23,24. Ein abgeschwächter Lebendimpfstoffstamm HLJ/18-7GD wurde durch die Löschung von sieben Genen erzeugt, darunter die sechs MGF_505/360-Gene und das EP402R-Gen, das CD2v kodiert. Studien an Schweinen haben die Sicherheit und Wirksamkeit dieses Impfstoffs gegen ASFV10 des Genotyps II gezeigt. Könnte dieser Impfstoffkandidat Schutz gegen das neu auftretende rekombinante Virus bieten? Um diese Frage zu beantworten, wurden Gruppen von fünf SPF-Schweinen intramuskulär mit 106 TCID50 von HLJ/18-7GD geimpft und dann am 28. Tag intramuskulär mit 103 HAD50 des rekombinanten Virus JS/LG/21 oder des Genotyp-II-Virus HLJ/18 geimpft nach der Impfung. Gruppen von vier ungeimpften Schweinen wurden auf ähnliche Weise wie die Kontrollen getestet.

Ähnlich wie in unserem vorherigen Bericht10 entwickelten die Kontrollschweine hohes Fieber und starben alle innerhalb von 10 Tagen nach der Belastung mit HLJ/18, und in den Hauptorganen und Lymphknoten wurde virale DNA nachgewiesen (Abb. 5). Im Gegensatz dazu waren die geimpften Schweine gut gegen die Herausforderung mit dem homologen Virus HLJ/18 geschützt: Die Schweine entwickelten keine klinischen Symptome und alle überlebten den 28-tägigen Beobachtungszeitraum (Abb. 5), obwohl in der Lunge virale DNA nachgewiesen wurde , Niere und zwei Lymphknoten eines Schweins sowie in der Mandel von drei Schweinen, die am Ende des Beobachtungszeitraums eingeschläfert wurden (Abb. 5). Die mit dem rekombinanten Virus JS/LG/21 infizierten Kontrollschweine entwickelten Fieber und starben innerhalb von acht Tagen nach der Belastung, wobei das Virus in den Hauptorganen und Lymphknoten nachgewiesen wurde (Abb. 5); Wir waren jedoch überrascht, als wir feststellten, dass alle geimpften Schweine ebenfalls Fieber entwickelten und innerhalb von 10 Tagen nach der Infektion starben (Abb. 5) und dass die Virusreplikationsraten in ihren Organen mit denen der Kontrollschweine vergleichbar waren (Abb. 5). ).Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der abgeschwächte Lebendimpfstoff HLJ/18-7GD keinen Schutz gegen das neu auftretende rekombinante ASFV bieten kann.

Gruppen von fünf SPF-Schweinen wurden mit 106 TCID50 von HLJ/18-7GD geimpft und dann am 28. Tag intramuskulär mit 103 HAD50 von HLJ/18 (a–c) oder dem rekombinanten Virus JS/LG/21 (d–f) provoziert nach der Impfung. Als Kontrollen wurden Gruppen von vier ungeimpften SPF-Schweinen getestet. Die Rektaltemperatur (a, d) und das Überleben (b, e) wurden täglich überwacht, und am Ende des Beobachtungszeitraums wurden Gewebeproben (c, f) von toten oder eingeschläferten Schweinen zum Nachweis viraler DNA mittels qPCR entnommen. Die gestrichelten schwarzen Linien zeigen die normale Rektaltemperatur (40 °C) von Schweinen. LN1, inguinaler Lymphknoten; LN2, submaxillärer Lymphknoten; LN3, mediastinaler Lymphknoten. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

In dieser Studie isolierten wir drei hochletale rekombinante ASFVs mit Mosaikgenomen, die zu 56,5 % aus Georgia07-ähnlichem Genotyp-II-Virus und zu 43,5 % aus NH/P68-ähnlichem Genotyp-I-Virus bestanden. Das rekombinante Virus ist bei Schweinen äußerst tödlich und übertragbar und entzieht sich vollständig der Immunität, die durch die Impfung mit einem attenuierten Lebendimpfstoff auf Basis des Georgia07-ähnlichen Genotyp-II-Virus hervorgerufen wird.

Das in China nachgewiesene NH/P68-ähnliche Genotyp-I-Virus SD/DY-I/21 ist nicht tödlich, verursacht jedoch bei Schweinen deutlich nekrotische Hautläsionen und Gelenkschwellungen12. Der niedrige Virulenzphänotyp des SD/DY-I/21-ähnlichen Genotyp-I-Virus ist hauptsächlich auf das Fehlen der MGF_505/360-Gene in seinem Genom und die fehlerhafte Expression des EP402R-Gens zurückzuführen12,13,25. Zwanzig Gene, darunter die MGF_505/360-Gene, das EP402R-Gen und das I177L-Gen, haben sich nachweislich als wichtig für die Virulenz des Genotyps II ASFV10,19,26,27,28,29,30,31,32,33,34 erwiesen und alle diese Gene liegen in den Fragmenten F2, F6 oder F20 der rekombinanten Viren vor (Ergänzungstabelle 4). Tierstudien legen nahe, dass die MGF_505/360-Gene und das EP402R-Gen eine Schlüsselrolle im hochtödlichen Phänotyp des rekombinanten Virus spielen. Wie andere virulente Faktoren zur hohen Pathogenität rekombinanter Isolate beitragen könnten, muss in Zukunft noch ermittelt werden. Obwohl die drei rekombinanten Viren aus Schweinen aus drei verschiedenen Provinzen in China isoliert wurden, deuten die ähnlichen Genomstrukturen darauf hin, dass sich das rekombinante Virus an einem Ort gebildet und dann verbreitet hat, und nicht, dass die drei rekombinanten Viren getrennt voneinander entstanden sind.

Die ASFVs des Genotyps II sind derzeit in vielen Ländern Europas, Afrikas und Asiens bei Schweinen weit verbreitet7,35. Mehrere gendeletierte lebende, abgeschwächte Viren, die auf den ASFVs des Genotyps II basieren, wurden von verschiedenen Gruppen erzeugt und als potenzielle Impfstoffe bewertet10,19,28,29,30,32,36,37. Der HLJ/18-7GD-Impfstoff bietet einen soliden Schutz gegen das homologe Genotyp-II-Virus, bietet jedoch keinen Schutz gegen das neu entdeckte rekombinante Virus, was darauf hindeutet, dass die Schlüsselelemente im Genotyp-II-Virus, auf die der HLJ/18-7GD-Impfstoff abzielt Die induzierende schützende Immunität wurde im rekombinanten Virus durch die des Genotyp-I-Virus ersetzt. Der fehlende Schutz könnte auch das Ergebnis des Überlagerungseffekts der Antigenabweichung des Genotyps I und der Immunevasionsfunktion von Genen sein, die vom tödlichen Genotyp-II-Virus stammen28,33,34. Frühere Studien haben gezeigt, dass abgeschwächte ASFV-Impfstoffkandidaten des Genotyps I einen Kreuzschutz gegen eine virulente Virusinfektion des Genotyps II induzieren könnten18,38,39. Daher lohnt es sich zu prüfen, ob andere abgeschwächte Impfstoffe einen Schutz gegen diese neu auftretenden Rekombinanten der Genotyp-I- und -II-Viren bewirken. Unsere vorläufigen Daten zeigten, dass JS/LG/21-7GD bei Schweinen stark abgeschwächt war und somit das Potenzial von JS/LG/21-7GD besteht, ein sicherer und wirksamer Impfstoff gegen virulente rekombinante Viren und ihre elternähnlichen Genotypen I und II zu sein Viren sollten weiter untersucht werden. Bisher waren die Fortschritte bei der Aufklärung des grundlegenden Mechanismus des Immunschutzes gegen ASFV begrenzt, was wiederum den Fortschritt bei der Impfstoffforschung und -entwicklung behinderte. Das rekombinante JS/LG/21 umgeht die schützende Immunität, die durch den abgeschwächten Lebendimpfstoffkandidaten HLJ/18-7GD vom Genotyp II induziert wird, vollständig, was uns sehr wichtige Hinweise und nützliche Informationen zur Erforschung des Schutzmechanismus für ASFVs liefert.

Zusammenfassend haben wir hier natürlich vorkommende Rekombinanten von ASFVs des Genotyps I und Genotyp II bei Schweinen in China nachgewiesen. Unsere Tierstudien zeigen, dass diese Viren bei Schweinen äußerst tödlich und übertragbar sind und dass der abgeschwächte Lebendimpfstoff auf der Basis des Genotyp-II-Virus keinen Schutz gegen diese rekombinanten Viren bieten kann.

Alle Experimente mit lebenden ASFVs wurden in den BSL-3/ABSL-3-Biosicherheitseinrichtungen am Harbin Veterinary Research Institute (HVRI) der Chinesischen Akademie der Agrarwissenschaften (CAAS) durchgeführt, wie vom Ministerium für Landwirtschaft und ländliche Angelegenheiten genehmigt. Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie der Volksrepublik China durchgeführt. Die Protokolle wurden vom Ausschuss für Ethik von Tierversuchen des HVRI der CAAS genehmigt (Genehmigungsnummern: 220401-03-GJ, 220421-03-GJ und 221027-02-GJ).

Primäre Schweine-Alveolarmakrophagen (PAMs) und periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) wurden aus der bronchoalveolären Lavage und EDTA-behandeltem Blut von 30 Tage alten, spezifisch pathogenfreien (SPF) Schweinen hergestellt, wie zuvor beschrieben15. Zur Beimpfung von PAMs wurden Blut oder homogenisierte Gewebeproben, einschließlich Lunge, Milz und Lymphknoten, verwendet. Am Tag 5 nach der Inokulation (pi) wurden die Zellüberstände in einer qPCR untersucht, die auf das B646L-Gen von ASFVs abzielte. ASFV-positive Zellüberstände wurden gesammelt und die Virusreinigung wurde in PAMs durch drei Runden limitierender Verdünnung durchgeführt. Das ASFV-Isolat wurde mithilfe eines Immunfluoreszenztests oder eines Hämadsorptionstests in PAMs titriert und als frei von Kontaminationen mit Bakterien, porzinem Circovirus Typ 2, Pseudorabiesvirus, porzinem respiratorischem und reproduktivem Syndromvirus oder klassischem Schweinepestvirus befunden. Das rekombinante Virus mit der Deletion der Gene EP402R, MGF_505-1R, MGF_505-2R, MGF_505-3R, MGF_360-12L, MGF_360-13L und MGF_360-14L wurde durch homologe Rekombination wie zuvor beschrieben10 erzeugt. Der gesamte Virusbestand wurde aliquotiert und bei –80 °C gelagert.

Die HAD-Aktivität jedes ASFV wurde wie zuvor in Lit. beschrieben bewertet. 15. Kurz gesagt, wurden zehnfach seriell verdünnte Viruslösungen in PBMCs mit 0,1 % Schweine-Erythrozyten in jeweils 96-Well-Platten inokuliert. HAD wurde 7 Tage lang täglich nach der Inokulation unter einem Mikroskop beobachtet. Die 50-prozentige HAD-Dosis (HAD50) für jedes Virus wurde mit der Reed- und Muench-Methode40 gemessen.

Genomische ASFV-DNA in Abstrichen, Gewebehomogenaten, Serum, EDTA-behandelten peripheren Vollblutproben und Zellüberständen wurde mit QIAamp® DNA Mini Kits (Qiagen, Deutschland) extrahiert und mit der von WOAH empfohlenen qPCR nachgewiesen, wie zuvor in Lit. beschrieben. 11, 41.

ASFV-Genomsegmente wurden durch PCR unter Verwendung spezifischer Primer und eines High-Fidelity-Reaktionssystems amplifiziert und unter Verwendung der Sanger-DNA-Sequenzierungsmethode wie zuvor in Lit. beschrieben sequenziert. 11, 12. Um den phylogenetischen Baum zu erstellen, wurden alle ASFV-Genome mit E-INS-i des Programms MAFFT v742 ausgerichtet und die mehrdeutig ausgerichteten Regionen wurden mit Gblocks-0.9143 ausgeschlossen. Die phylogenetische Analyse wurde mithilfe der Maximum Likelihood (ML) abgeleitet und ModelFinder wurde verwendet, um das am besten geeignete Modell gemäß dem Bayes'schen Informationskriterium (BIC)44 auszuwählen. Die ML-Analyse wurde mit IQ-Tree45 abgeleitet und das beste Modell war GTR + F + R3. Bootstrap Branch Support Values ​​(MLBS) wurden mit 1000 schnellen Bootstrap-Inferenzen ermittelt und anschließend in einer gründlichen ML-Suche des Datensatzes gesucht. Das Diagramm des ASFV-Genoms wurde mit dem BLAST Ring Image Generator (BRIG) mit der gesamten Genomsequenz von JS/LG/21 erstellt. Die BLAST-Option von BRIG war ncbi-blast-2.13.0+. Verschiedene Rekombinationsregionen und die offenen Leserahmen (ORFs) wurden im Vergleich mit denen des Genotyp-II-Virus HLJ/18 bzw. des Genotyp-I-Virus SD/DY-I/21 analysiert. Für die Ausrichtung mehrerer Sequenzen wurde biologische Software verwendet, darunter Snapgene® 4.1.8 und MEGA X (https://www.megasoftware.net). Die in dieser Studie verwendeten Primersequenzen für die PCR-Amplifikation und -Sequenzierung sind im Ergänzungsdatensatz 2 aufgeführt.

Um die Virulenz von ASFV bei Schweinen zu bewerten, wurden Gruppen von 7 Wochen alten SPF-Landrace-Schweinen, unabhängig vom Geschlecht, vom Labortierzentrum des HVRI intramuskulär (im) mit 106 HAD50 oder 103 HAD50 von JS/LG/21 geimpft. Ab dem ersten Tag der Infektion wurden dann zwei weitere naive SPF-Schweine zusammen mit den infizierten Schweinen jeder Gruppe gehalten, um die Übertragung von JS/LG/21 zu bewerten. Alle Schweine wurden täglich auf Überleben und klinische Symptome überwacht. Orale Abstriche, rektale Abstriche und mit EDTA behandeltes Blut wurden zur Quantifizierung der Virus-DNA mittels qPCR zu den angegebenen Zeitpunkten pi oder nach dem Kontakt (p.ct.) gesammelt. Organe und Lymphknoten wurden von toten oder eingeschläferten Schweinen entnommen und mithilfe von qPCR wie zuvor beschrieben auf virale DNA untersucht11,41.

Um die Virulenz von JS/LG/21-7GD bei Schweinen zu untersuchen, wurden zehn 7 Wochen alte SPF-Landrace-Schweine, unabhängig vom Geschlecht, mit 106 TCID50 von JS/LG/21-7GD geimpft. Alle Schweine wurden 28 Tage lang täglich auf Rektaltemperatur, Überleben und klinische Symptome überwacht. Schweineseren wurden zu den angegebenen Zeitpunkten für den ASFV-spezifischen Antikörpernachweis mithilfe eines blockierenden ELISA-Kits (hausintern) gesammelt46.

Um die Schutzwirkung des abgeschwächten Lebendimpfstoffs HLJ/18-7GD vom Genotyp II gegen die neu auftretenden ASFV-Isolate zu bewerten, wurden Gruppen von 7 Wochen alten SPF-Landrace-Schweinen unabhängig vom Geschlecht mit 106 TCID50 HLJ/18-7GD geimpft wurden dann am Tag 28 nach der Impfung (pv) mit 103 HAD50 von JS/LG/21 oder HLJ/18 provoziert. Gruppen von vier ungeimpften Schweinen wurden gleichzeitig als Kontrollen provoziert. Alle Schweine wurden 28 Tage nach der Exposition (p.ch.) täglich auf Rektaltemperatur, Überleben und klinische Symptome überwacht. Organgewebe, einschließlich Herz, Leber, Milz, Lunge, Niere, Mandeln und Lymphknoten, wurden von den toten Schweinen oder den überlebenden Schweinen, die am Ende des Beobachtungszeitraums eingeschläfert wurden, entnommen, um die Viruslast mittels qPCR nachzuweisen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle Daten waren im Manuskript oder in den Zusatzdaten verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt. Sequenzen der in dieser Studie verwendeten Viren wurden in der GenBank hinterlegt (Zugangsnummern: OQ504954 für HeN/123014/22, OQ504955 für IM/DQDM/22 und OQ504956 für JS/LG/21). Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Diese Studie verwendete keinen benutzerdefinierten Code oder mathematischen Algorithmus.

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Wir danken Susan Watson für die Bearbeitung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde vom National Key R&D Program of China (2021YFD1800101 und 2019YFE0107300) und dem Applied Technology Research and Development Project der Provinz Heilongjiang (GA19B301) unterstützt. Alle drei Förderungen wurden an die ZB vergeben

Diese Autoren trugen gleichermaßen bei: Dongming Zhao, Encheng Sun, Lianyu Huang, Leilei Ding, Yuanmao Zhu.

Staatliches Schlüssellabor für die Kontrolle und Prävention von Tierkrankheiten, Nationale Hochsicherheitseinrichtungen für die Kontrolle und Prävention von Tierkrankheiten, Harbin Veterinary Research Institute, Chinesische Akademie der Agrarwissenschaften, Harbin, Volksrepublik China

Dongming Zhao, Encheng Sun, Lianyu Huang, Leilei Ding, Yuanmao Zhu, Jiwen Zhang, Dongdong Shen, Xianfeng Zhang, Zhenjiang Zhang, Tao Ren, Wan Wang, Fang Li, Xijun He und Zhigao Bu

Jiangsu Co-Innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou University, Yangzhou, Volksrepublik China

Zhigao Bu

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DZ und ZB koordinierten das Forschungsprojekt, analysierten die Daten und verfassten das Manuskript. ES, LH, LD und YZ haben Experimente entworfen und durchgeführt. JZ, DS, XZ, ZZ, TR, WW, FL und XH führten Experimente durch. DZ, ES, LH, LD und YZ haben gleichermaßen zu dieser Studie beigetragen. Korrespondenz sollte an Zhigao Bu gerichtet werden.

Korrespondenz mit Zhigao Bu.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Linda Dixon, Kimberly VanderWaal und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Zhao, D., Sun, E., Huang, L. et al. Bei Schweinen wurden hochtödliche rekombinante Afrikanische Schweinepestviren der Genotypen I und II nachgewiesen. Nat Commun 14, 3096 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38868-w

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Eingegangen: 19. Oktober 2022

Angenommen: 11. Mai 2023

Veröffentlicht: 29. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38868-w

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